用户文章 垂直流人工湿地中抗生素和氮的同时去除：基质的影响和微生物功能的响应

该研究由济南大学王惠教授课题组完成，研究生袁英睿和杨宝山副教授为并列第一作者，王惠教授为通讯作者。王惠教授课题组主要从事土壤污染毒理学与污染土壤修复、环境微生物多样性及其功能开发和水体污染控制的微生物机制研究。近年来，其团队成员主持国家级、省部级和企业委托项目多项。人工湿地处理废水研究是其课题组近两年开展的新方向，团队成员主要发挥已经开展的微生物和植物修复机理的优势，探讨不同人工湿地作业过程进行废水处理的效果及其机理，研究成果已陆续在Bioresource and Technology 和Chemosphere等杂志上发表。

题目：垂直流人工湿地中抗生素和氮的同时去除：基质的影响和微生物功能的响应

期刊：Bioresource Technology

影响因子：6.669

发表时间：2020年

技术手段：16S测序

一、研究背景

抗生素频繁使用会造成潜在的生态环境问题和对人体健康的危害，其传播的负面影响引起了人们的极大关注，特别是小型废水处理厂是抗生素污染。目前，尚无特别合适的技术可用于从现有废水处理厂中去除抗生素，因此，寻找成本效益高、可持续、环境友好的解决方案来解决废水中的抗生素问题至关重要。

人工湿地已广泛用于去除不同废水中抗生素，其中垂直流人工湿地（VFCW）的上好氧层和下缺氧层的特性为细菌降解抗生素提供了有利的环境。其中，基质材料不仅对污染物的去除起着关键作用，而且影响生物膜的形成，导致功能微生物的变化，从而影响氮和有机物的去除效率。已有研究报道，在垂直流人工湿地中添加生物炭和锰矿石等廉价环保的基质，可以增加去除污染物的效率。但是，生物炭对有效同时去去除抗生素和氮的影响尚未报道。底物材料不仅起着去除污染物的关键作用，而且还影响生物膜的形成，导致功能性微生物的变化，从而改变了氮和有机物的去除效率。生物降解是化学武器去除氮中最关键的过程，但是抗生素的存在会影响微生物群落。因此所以，研究不同基质结构的垂直流人工湿地在同时去除抗生素和氮的过程中，其微生物群落和功能的变化具有重要意义。

二、材料与方法

基材：鹅卵石、沸石、锰矿石、生物炭、石英砂等5种基质。

实验装置和垂直流人工湿地实施：设计三个规格相同的垂直流人工湿地，容积为30 L，三个VFCWs分别被编码为CW-Z、CW-M和CW-C。除沸石层外，CW-M和CW-C的基质与CW-Z相同，沸石层分别以1:1的体积比添加Mn矿或生物炭。

根据水温将实验分为两个阶段，探讨温度对不同基质VFCWs去除污染物的影响。

第一阶段（前60天）和第二阶段（后60天）水温分别保持在20±2°C和27±2°C。试验开始前，收集90L二级废水，加入三种VFCW进行微生物预培养。一个月后种植芦苇，以6株/VFCW的密度种植。种植芦苇1个月后，模拟废水在72h水力停留时间（HRT）条件，以下流方式泵入系统。每个系统在一个循环（72小时）后手动排水，然后立即重新注入新的废水。废水处理试验持续时间为120天，同时在废水中加入较高浓度的抗生素盐酸环丙沙星和磺胺二甲基嘧啶。

图1

水取样和分析：在收集进水样品的同时，从微观结构底部采集出水样品，以测量COD、NH4+-N、NO3--N和TN。通过高效液相色谱法每隔6天检测一次废水中的抗生素浓度。测量每个样品的溶解氧（DO）值和水温，每个样品的目标参数进行三次测试。

DNA提取与基因定量：运行120d后，从各单元收集根际土壤和基质上形成的生物膜。洗脱生物膜和土壤样本汇总。微生物DNA用试剂盒提取。通过RT-PCR对6个氮转化相关功能基因和5个耐药基因进行定量分析。

三、结果

图2

1. 基质结构对抗生素去除的影响

总的来说，VFCW对盐酸环丙沙星的去除效果显著。CW-M处理的污染物去除率最高（93.70%），其次是CW-C（88.05%）和CW-Z（83.71%）。CW-M和CW-C中盐酸环丙沙星的高去除率是由于锰矿和生物炭具有比表面积大、微孔多的物理特性，增强了对污染物和微生物的吸附，也促进了抗生素的降解。但是所有的容器都被玻璃纤维网包裹，这可能抑制了光分解过程，导致盐酸环丙沙星的整体去除率略有降低。

磺胺二甲基嘧啶在CW-Z、CW-M和CW-C中的平均去除率分别为48.85%、69.38%和56.57%，最高去除率小于70%，与盐酸环丙沙星的去除率相比明显降低。世卫组织指出，与喹诺酮类抗生素的去除率相比，VFCW中磺胺类抗生素的去除率要低得多。在CW-M处理中，磺胺二甲基嘧啶的去除率也最高，原因可能是锰矿石中的铁和锰氧化物具有较高的氧化还原电位，当氧化还原发生时，它们能积极参与抗生素的降解。另一个原因可能是磺胺类药物倾向于被带负电的物质吸附，因为磺胺类药物在低pH值下以阳离子形式提供。在本研究中，CW-M的pH值为6.6，这可能会提高磺胺二甲基嘧啶的去除率。由于抗生素主要以两性离子或阳离子形式存在，生物炭在弱酸性pH下对磺胺类抗生素有较强的吸附作用。

图3

2.基质类型对氮素去除的影响

即使在盐酸环丙沙星和磺胺二甲基嘧啶存在下，CW-M和CW-C中TN，NH4+-N和COD的浓度也可以达到中国的I（A）类排放标准。与前60天运行相比，后60天运行对TN、NH4+-N和NO3--N的去除率更高。硝化细菌对水温敏感，脱氮的最佳温度为28°C至36°C。在本研究中，前60天的操作温度为20±2°C，后60天的操作温度为27±2°C，这是微生物生长、繁殖和生化过程的适宜温度，提高了氮的去除率。去除率的增加也可能是由于生物膜随着运行时间的推移而逐渐增加。在这项研究中，废水中的化学需氧量（COD）浓度在运行60天后显著升高。由于高温有利于微生物活动，VFCW中COD的最佳去除率为夏季。COD浓度的变化与CIPH（盐酸环丙沙星）和SMZ（磺胺二甲基嘧啶）的去除率一致。这些结果证实，这两种抗生素大多降解成较小的分子，但没有形成二氧化碳和水。

此外，CW-M中TN的平均去除率为71.71%，最低浓度为11.60 mg/L，而CW-C中TN的平均去除率仅为62.98%，最低浓度为15.18 mg/L。氨氮和NO3--N的去除率CW-M略高于CW-C，但无统计学差异。据报道，添加锰矿可以通过强化硝化和缺氧反硝化，结合锰矿还原，提高NH4+-N和NO3--N的去除率。有实验证实了Mn（II）（氧化后Mn氧化物的产物）可以为反硝化提供电子供体，进一步有助于提高NO3--N的去除率。报告说，添加锰氧化物可将VFCW中的NO3--N去除率提高约8%。结果表明，与CW-Z和CW-C相比，CW-M对NO3--N的去除率分别提高了7.47%和1.40%。在本研究中发现在VFCWs的基质中加入锰矿和生物炭是提高抗生素污染废水中氮去除率的一种有效方法。

图4

3. 三种VFCWs中N功能基因和ARGs的差异

氮转化功能基因在三个微观结构中的绝对丰度如上图所示。微生物去除氮的指标通常反映在amoA、nxrA、Amx、nirK、nirS和nosZ的丰度上。氨单加氧酶和亚硝酸盐氧化酶在需氧条件下通常具有较高的活性。氨单加氧酶由amoA基因编码，能催化NH4+生成NO2-。类似地，亚硝酸盐氧化酶被nxrA基因加密，nxrA基因可以催化NO2-到NO3-，amoA和nxrA在CW-M和CW-C中的丰度较高，而在CW-Z中的丰度较低。

结果表明，添加锰矿和生物炭有利于促进硝化细菌的生长和繁殖，有利于提高对CW-M和CW-C而非CW-Z中NH4+-N的去除效率。Amx是参与厌氧氨氧化的代表基因，与CW-Z和CW-M相比，CW-C中Amx的拷贝数显著增加。尽管CW-C具有较高的Amx丰度，但CW-M对NH4+-N的去除率较高。这一结果意味着厌氧菌的生长被抑制，并且厌氧氨氧化的功能在CW-C中没有得到很好的发挥。另一个可能的原因可能是生物炭具有多孔结构，允许氧气循环产生一个好氧环境，从而抑制厌氧细菌的生长。

锰矿石中所含的锰（II）可能通过电子的给体给电子而增强了反硝化作用。三种VFCWs中nirK和nirS的拷贝数以CW-Z < CW-M < CW-C，说明Mn矿石和生物炭对nosZ基因没有明显影响。nosZ的绝对丰度在本研究中显著较高，这意味着在这三种VFCWs中更有效地实施反硝化。有研究报告称，添加磺胺类抗生素可增加有助于去除废水中过量氮的功能基因的丰度。微生物在抗生素的选择性压力下可能产生ARG，这是所有生物系统的缺点。细菌16sRNA绝对丰度在3种VFCWs中差异不显著，说明添加Mn矿和生物炭对细菌生物量没有显著影响。

int1基因在细菌对多种药物特别是季铵化合物和磺胺类药物的耐药性中起着重要作用。细菌可以通过int1编码合酶捕获周围环境中的耐药基因。在我们的实验中，CW-C中int1基因的丰度为4.87×107 copies/g，分别是CW-Z和CW-M的6.53和13.68倍。值得注意的是，CW-C中没有检测到喹诺酮类药物的代表性耐药基因qnrA和qnrS基因，这表明附着在生物炭基质上的生物膜对喹诺酮类药物不敏感，并且添加生物炭可以减少喹诺酮类药物耐药基因的产生。然而，所有VFCWs中均检测到sulI和sulII基因。CW-Z（7.99×107 copies /g）中sulI的丰度显著高于CW-M（1.81×107 copies /g）和CW-C（2.85×107 copies /g），说明锰矿和生物炭都能降低抗磺胺基因。此外，在所有的VFCWs中，磺胺类抗药性基因的丰度远高于喹诺酮类抗药性基因的丰度，说明磺胺抗性基因可以在废水处理中快速产生并传播。

表1

4. 基质类型对细菌群落的影响

α多样性评估细菌群落的丰富度和多样性。

CW-M的丰富度估计值（观察物种和Chao1指数）和多样性指数（Shannon和Simpson指数）均显著高于其它两个VFCWs。世卫组织发现，锰矿的存在可以提高细菌群落的丰富度和多样性，因为有更好的含氧环境。也证明了生物炭可以增加CWs中的细菌丰富度和多样性。在本研究中，CW-C的微生物群落多样性显著低于CW-Z和CW-M。这可能与VFCW中不同基质中抗生素对细菌群落的不同选择压力有关。一项研究表明，一些对抗生素高度敏感的细菌被消灭，其他细菌在抗生素的长期刺激下富集，可能导致细菌多样性下降。此外，int1基因丰度可以反映微生物对抗生素的敏感性，int1基因的数量在CW-C中最高，这表明CW-C中的细菌群落对抗生素更为敏感。

基质微生物去除污染物是CWs的关键机制。120天后，在三个VFCW中共发现45个门。VFCWs中高相对丰度的前20个门如图5所示。变形杆菌（47.14%–62.26%）是所有系统中的主要门，其次是假丝酵母（9.85%–22.67%），放线菌（9.02%–12.69%），酸杆菌（3.12%–7.60%），拟杆菌（1.79%-5%）和厚壁菌（0.84%-5.82%）。变形菌门已被证明是去除营养物质和一些有机污染物的重要组成部分。CW-M中变形菌门丰度最高可能有助于达到抗生素和氮最佳去除率。糖化假丝酵母在活性污泥中经常被检测到，在有机物和糖类化合物的降解中发挥着重要作用。CW-M中糖化假丝酵母的相对丰度明显低于CW-C，这与CW-M中COD的去除率低于CW-C一致（表1）。此外，先前的研究表明，在接触抗生素的底物中，放线菌（不是CWs中的优势菌门）的丰度增加。作为多功能碳氢化合物的降解剂，放线菌被证明可以参与某些有机物的去除，如杀虫剂。与CW-Z（9.02%）和CW-C（12.24%）相比，CW-M（12.69%）的放线菌比例更高（图5），这与观察到的较高的盐酸环丙沙星和磺胺二甲基嘧啶去除率（CW-M分别为93.71%和69.24%，CW-C分别为83.69%和48.51%，CW-Z分别为87.97%和56.49%）相对应（图2）。结果表明，与CW-Z体系相比，CW-M和CW-C体系对细菌群落的生长更有利于抗生素和氮的去除。

图5

图6

5. 抗生素和氮同时去除与微生物群落的相关性

以相对丰度大于1%的8个门水平微生物为研究对象，采用冗余分析法（RDA）对NH4+-N、NO3--N、TN、COD、SMZ、CIPH等微生物群落进行了研究，探讨了微生物群落与环境因子的关系。如图5所示，三个VFCW明显分为三个相。该角度表明，SMZ（磺胺二甲基嘧啶）和CIPH（盐酸环丙沙星）的去除率与变形杆菌、放线菌呈正相关。值得注意的是，CW-M最有利于变形杆菌的生长，而变形杆菌与CIPH和SMZ抗生素以及N的去除呈正相关。据报道，变形杆菌可以降解污水中的氟喹诺酮类抗生素。RDA结果也证实了变形杆菌对CW-M中CIPH和SMZ的高去除率。此外，除portal bacteria，scleroderma 和acid bacteria外，大多数菌种的NH4 + -N，NO3--N和COD去除率均为正值。在CW-M处理和CW-C处理中发现了类似的结果（图6）。放线菌控制了NH4+-N和NO3--N的转化，世卫组织报告说，放线菌在脱氮过程中发挥了重要作用，与观察到的与NH4+-N和NO3--N的较小角度相对应（图6）。扁丝酵母、糖化假丝酵母和拟杆菌的箭头与COD的去除率呈正相关，且分布在CW-C中，说明CWC中COD的最高去除率可能与功能微生物的增殖有关。因此，RDA结果证实，CW-M和CW-C中的底物类型对细菌群落组成有显著影响，对抗生素和氮的高去除起着关键作用。

6. 在实际工程中的应用

这项研究表明，锰矿在去除硝酸盐氮和抗生素方面具有巨大潜力，可推荐用于大规模VFCW，特别是医疗和水产养殖废水的处理，这些废水已被证实含有高浓度的抗生素。此外，研究结果还表明生物炭在湿地基质中抑制喹诺酮类耐药基因的潜在应用，并在不同的操作条件下进一步研究。因此，从各种废弃生物质中筛选基质对人工湿地的未来运行至关重要。

四、结论

CW-M对盐酸环丙沙星、磺胺二甲嘧啶和氮的去除率最佳，这归因于较高的亲和力和氧化还原条件，生物炭通过增加相关微生物的数量，抑制了喹诺酮类耐药基因的产生，提高了COD的去除效率。锰矿石和生物炭均提高了amoA、Amx、nirK和nirS的绝对丰度，从而提高了CW-M和CW-C的脱氮效率。总之，锰矿石和生物炭均降低了同时去除VFCWs中抗生素和氮的负面影响。

该文章由联川项目经理张骏解读

张骏，负责辽宁省高通量测序业务，自2017年8月加入联川生物以来，已经服务过200+客户，累计完成项目500+。

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